Ciblage Génique
Le ciblage génique est l'ensemble de toutes les méthodes utilisées pour induire une modification dirigée, en un site précis, dans le programme génétique d'une cellule vivante ou d'un organisme vivant. La « génétique inverse » modifie le génotype, avant d'étudier le phénotype modifié d'un organisme vivant. Le ciblage génique est l'approche rationnelle de la génétique inverse. Elle englobe les méthodes employées pour procéder à la modification précise d'une séquence dans un chromosome, en un site précis. L'ingénierie rationnelle des génomes utilise des approches efficaces du ciblage génique.
Réparation des cassures double brin (R-CDB)
La R-CDB est l'un des principaux rôles de la recombinaison homologue. La R-CDB est l'une des principales voies de réparation naturelles des cellules, mais sa maîtrise est également un formidable outil pour les scientifiques. La plupart des technologies MRS de Cellectis se fondent sur la R-CDB.
Lorsqu'une CDB survient dans une molécule d'ADN, la cellule n'a d'autre choix que de la réparer ou de subir une perte de chromosomes qui peut être létale. Il existe au moins deux grandes familles de mécanismes de réparation, qui reposent chacun sur des phénomènes moléculaires totalement différents.
Premièrement, la cassure peut être réparée par simple ligation. Ce processus est souvent aussi appelé « jonction des terminaisons non-homologue » (NHEJ - non homologous end joining), mais également recombinaison illégitime ou encore recombinaison non homologue. Cette religation peut être parfaite, lorsqu'elle restaure simplement la séquence originale, ou imparfaite lorsqu'elle ajoute ou ôte des séquences pouvant aller d'un nucléotide à plusieurs Kb. Chez les mammifères, ce processus dépend du complexe ADN ligase IV/XRCC4 (Dnl4/Lif1 chez la levure S. cerevisiae) et du complexe protéine kinase ADN-dépendant, dont les DNA-PKcs, ainsi que des protéines Ku70 et Ku80 (chez S. cerevisiae, il n'existe pas de DNA-PKcs). Le NHEJ sous-tendrait l'insertion aléatoire pendant la transgenèse : l'ADN apportant la transformation, intégré par des CDB sporadiques dans le chromosome.
Deuxièmement, les CDB peuvent être réparées par recombinaison homologue. Cette réparation pose une première condition : la disponibilité de séquences homologues. Selon la localisation de ces séquences, il existe deux principales voies de recombinaison, présentées dans l'illustration ci-dessous.
En présence de séquences répétées directes, adjacentes à la CDB, la réparation peut avoir lieu selon un processus appelé « annealing » simple brin (SSA). Le SSA est une voie de recombinaison non conservatrice, qui entraîne la délétion de l'une des répétitions ainsi que de toutes les séquences intermédiaires. Toutefois, si les séquences de part et d'autre de la cassure trouvent une autre homologie sur un autre site du génome, un transfert non réciproque de matériel génétique survient au départ de la séquence homologue, qui sert alors de matrice donneuse. Ce processus est appelé conversion génique.
Le SSA et la conversion génique sont deux processus distincts en termes du mécanisme, des résultats et de l'environnement génétique. La conversion génique dépend de plusieurs protéines, parmi lesquelles Rad52, Rad51 et de nombreux paralogues de Rad51 (Rad51B, Rad51C, Rad51D, XRCC2 et XRCC3 chez les mammifères), Rad54, et les gènes BRCA1 et BRCA2. Le mécanisme de SSA semble moins exigent, chez Saccharomyces cerevisiae ou il requiert seulement la protéine Rad52.
L'efficacité des mécanismes de NHEJ, de SSA et de conversion génique varie fortement, et dépend du type d'organisme ou de cellule. De façon générale, la recombinaison homologue semble être le mécanisme le plus actif dans les cellules méiotiques, la levure Saccharomyces cerevisiae, la mousse Physcomitrella patens, dans la lignée de cellules lymphoïdes aviaires DT40 et dans un certain nombre de variantes de la souche d'Escherichia coli. Dans la plupart des cellules végétales et mammifères, l'efficacité de l'intégration aléatoire par rapport à l'intégration homologue de transgènes suggère que la recombinaison homologue est très inefficace. Pourtant, cette idée fréquemment avancée est à tempérer : lorsqu'une CDB de l'ADN chromosomique peut être générée au niveau d'un locus bien précis, l'intégration homologue peut malgré tout survenir dans plusieurs pour cents de cellules.
De nombreux MRS développés par Cellectis se fondent sur ce processus, qui permet d'obtenir une conversion génique efficace par l'induction d'une CDB.
